摘 要
聚乙二醇化重组蛋白药物是由聚乙二醇（PEG）对重组蛋白药物修饰而成，在保留原型重组蛋白生物学活性前提下，克服原型蛋白体内代谢快、稳定性差、需多次给药等缺点，但也存在一定的特殊性，在对其质量控制的相关指导原则有限的情况下，通过对其生产用原材料控制、生产过程中工艺控制、中间产品及终产品的质量控制、稳定性研究等方面进行探讨，为其研究开发和生产质量控制提供一定参考。
聚乙二醇化重组蛋白药物是通过聚乙二醇（PEG）端基与重组蛋白药物的氨基酸序列侧链基团或N末端、C末端氨基/羧基发生共价反应修饰而成的治疗性生物制品，目的是在保留原型重组蛋白生物学活性前提下，克服原型蛋白体内代谢快、稳定性差、需多次给药等缺点，同时PEG修饰后具有提高重组蛋白药物稳定性或者降低其免疫原性等优点。自1990年美国食品药品监督管理局批准第一种PEG化蛋白药物(PEG-牛腺苷脱氨酶，Adagen)，该类药物研发迅速成为行业内布局长效化蛋白药物的一种途径。当前发展趋向于通过控制聚合反应条件，结合PEG端基化学改构和基因工程技术，实现PEG定点修饰。已上市的PEG化重组蛋白药物包括干扰素、生长激素拮抗药、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子等，均取得了不错的治疗效果和经济效益。相比较原型蛋白，PEG化重组蛋白在生产用原材料控制、生产过程工艺控制、中间产品及终产品的质量控制、稳定性研究等方面都存在一定的特殊性，本文将从以上几个方面对该类制品的质量控制一般策略进行归纳和总结，以便于行业对产品控制做进一步的思考。
1、 生产用原材料控制
1.1 原型蛋白质量控制
蛋白表达系统涉及大肠杆菌、酵母菌及哺乳动物细胞等多种系统，不同系统表达重组蛋白翻译后修饰水平存在明显差异，其质量控制手段也各不相同，在原型蛋白的制备过程中关注发酵及纯化工艺对相关工艺与产品杂质的控制及去除能力，以便于后续偶联修饰时减少不必要的干扰。
明确对用于PEG修饰的原型蛋白的质量控制标准，原则上应不低于原型蛋白质量标准控制的要求，必要时用于PEG修饰的原型蛋白质量标准的某些项目应高于原标准规定，如纯度项目等。
1.2 PEG的质量控制要求
PEG是由环氧乙烷聚合而成一种不带电荷的聚合物，分子量大小可根据工艺需要自行控制。由于修饰目标蛋白的不同，需使用不同活化形式PEG，官能化PEG是一类具有官能性基团的PEG衍生物，又称作活性PEG。该原料是生产过程中的主要物料，对产品质量起到关键作用。加强对修饰物料的质量控制，保证批间一致性，明确其关键质量属性（包括活性基团种类、拟成键键型、分子形态、分子量范围等）的质量标准并进行控制。
物料PEG控制至少应包括以下项目，并对其方法的准确性进行验证或确认：平均分子量及多分散度、端基活性、端基取代率、残留溶剂、二丁基羟基甲苯（BHT）含量、细菌内毒素。加强对使用的PEG中可能存在的双醇、断裂与非活化PEG等特定杂质及其他需要控制的相关杂质的分析及限量控制。
因官能化PEG本身稳定性较差，在对其贮存、分装和使用过程中的条件应进行规定，防止高温、氧化和潮解等环境因素使其活化基团失活，从而导致修饰效率的降低。不同供应商的PEG物料一般不混合使用。
1.3 其他生产用原辅料
PEG化重组蛋白制品生产中涉及的物料包括原材料、辅料、关键耗材、内包装材料等，应基于中国药典2020版相关要求、对产品质量的影响、对生产工艺的关键性确定风险等级并开展相应的评估，采取与之相对应的管理方式，包括供应商管理、物料验收、检验、储存、放行、使用等要求。
任何关键物料的变更，都应按照国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布的《已上市生物制品药学变更研究技术指导原则（试行）》的要求，对变更进行充分地研究及必要的验证，以证明对上市后PEG化重组蛋白制品的质量和疗效不产生不利影响。
2、 生产过程工艺控制
严格按照经批准的制造与检定规程组织生产和质量控制，并按照经验证的工艺时限、环境及其他要求严格控制生产过程。关注工艺的过程控制，包括产品质量属性和工艺参数，控制措施应有能力确保产品满足既定的质量属性及可接受标准。
保持工艺验证的连续性和一致性。生产工艺应经过至少连续3批的工艺验证，以确认批次内的均一性和批次间的稳定性。首次工艺验证时，制剂生产使用的原液也应为工艺验证批次，验证的内容须能确定药品的关键质量属性满足可接受标准，并有额外检测项目和取样考虑，以确保药品的有效性和安全性。工艺验证的项目应至少包括工艺稳健性、细胞或菌体生长曲线、表达量分析、杂质去除能力检测、过程控制参数汇总以及半成品的混合均一等。
PEG修饰方式包括定点、单位点随机或多位点随机修饰等方式，修饰工艺的选择应设定适宜的反应条件，以降低重组原型蛋白药物的活性损失及可能的修饰副产物。修饰过程中采取必要的控制措施减少修饰产物的不均一和异构体的产生，后续的纯化工艺确保将非目的修饰产物控制到质量标准的范围内；修饰过程中严格按照经批准的工艺规程进行操作，禁止为实现特异性定点修饰而非法添加其他无法在后续纯化工艺中去除的物料；修饰过程中建立适宜的工艺过程控制，以保证偶联反应的批间一致性，设定关键工艺参数的可接受限值范围，包括PEG的加入方式、PEG与原型蛋白的投料比、缓冲液的组成及酸碱度、反应条件等；采用适宜的方法对修饰反应的修饰液中原型蛋白修饰率进行控制，防止原型蛋白未修饰或过度修饰的量超出控制范围。
生产过程中各种缓冲液的储存应有储存条件及时限规定，并有验证数据的支持；缓冲液的储存应有避免微生物和内毒素污染的措施，且缓冲液应在规定的有效期内使用；对关键工艺步骤，如原型蛋白原液纯化等中间步骤建立微生物限度及内毒素控制质量标准，并按规定进行检测。
不同生产阶段纯化须分别使用专用的层析介质，不得混用；不同批次之间，应当对层析分离柱进行清洁或消毒，必要时应定期对层析介质的柱效进行测定。
未经注册批准、修饰率不符合要求的修饰后原液及中间产物不得进行返工及重新加工。
3、 中间产品及终产品的质量控制
PEG化重组蛋白药物的质量控制与修饰蛋白的分子大小、修饰位点与修饰程度、结构特征、质量属性复杂程度以及生产工艺等息息相关。应采用适宜方法对原液质量进行检测，必要时应与参比品进行比较。原液的含量测定方法与成品制剂的含量测定方法显著不同时，应考虑方法之间的测定误差，避免因此引发的原液投料偏差。
质量控制应关注修饰前后其关键质量属性的变化，如生物学活性、修饰位点、分子大小变异体、电荷变异体以及高级结构、游离PEG含量、修饰度及必要的杂质检测等；关注工艺和产品相关杂质的情况，尤其是游离PEG含量、未修饰原型蛋白、过修饰蛋白、溶剂残留等指标；关注修饰工艺对原型蛋白一级结构（如氨基酸序列完整性、二硫键连接）、糖基化修饰和翻译后修饰（如有）等的影响。关注稳定性考察PEG化重组蛋白制品（原液、制剂及必要中间体）储存过程中PEG的脱落情况以及多聚体产生情况，任何超趋势情况都应进行调查。
采用不同的分析方法多角度对修饰后产物的纯度开展检测，方法至少应包括反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯度和体积排阻色谱（SEC-HPLC）纯度或者其他2种以上纯度分析方法等。分析方法在不同PEG化蛋白制品中应经验证，并有适宜的分离度和信噪比，以保证方法的准确性。RP-HPLC纯度检测，因PEG疏水性较强，经过修饰后制品的疏水性变强，而多修饰PEG制品比单修饰制品疏水性更强。利用反相高效液相层析的不同有机相浓度，实现未修饰、单修饰和过修饰制品的分离，从而可以检测目的产物的杂质含量。SEC-HPLC纯度检测，应用分子筛层析原理，分子量大的蛋白质在层析柱中移动速度快，而分子量小的蛋白质移动速度慢，根据移动速度不同，能够分离检测出不同分子量的未修饰、单修饰和过修饰制品。
产品肽图与平行测定的参考品比较确定一致性，建立产品专属的肽图鉴别方法，如与原型蛋白相同的方法，应对其方法适用性和试验条件进行充分的方法学验证，使得通过比较修饰前后制品的肽图，可直观分析发生修饰的肽段位置。
采用适宜的方法及对照品对修饰后产物进行蛋白质含量的测定，测定时通过适宜的方法排除PEG等物料对Folin-酚法等常规蛋白含量测定方法的干扰。
对原型蛋白PEG修饰程度进行控制，包括但不限于以下内容：修饰率、修饰位点异构体相对含量、PEG修饰个数范围及相关含量、修饰产物分子量分布、等电点等项目，该部分内容可在原液生产阶段加以控制，以保证工艺去除杂质的能力。
基于不同产品考虑，选用适宜方法对修饰后产物进行氧化产物、脱酰胺产物、游离PEG含量、原型蛋白及结构不完整分子定量分析，对宿主蛋白、外源性DNA及其他工艺杂质如修饰剂、催化剂、有机溶剂等残留物进行控制。通过串联离子交换和尺寸排阻色谱法或其他适宜的方法将游离PEG从PEG化重组蛋白制品中分离出来，并用蒸发光检测器进行检测，通过与PEG标准曲线比较进行定量分析，计算制品中游离PEG的含量并严格进行控制；检验中关注PEG标准溶液的稳定性问题。
原则上应采用同质参考品用于产品的质量控制，如采用原型蛋白等替代参考品，对其适用性进行充分验证，如PEG化重组蛋白已证明对原型蛋白的生物学活性等指标确有影响，则必须制备并采用同质参考品用于质量控制。参考品的有效期基于稳定性考察得到，在考察过程中有能够检测参考品结构和特性发生变化的检测项目；在新制备参考品时，应按照要求对新批次参考品进行检定，包括结构分析和表征研究，同时与初始或上一代参考品开展桥接实验。
4、 稳定性研究方面一般要求
PEG化重组蛋白药物对环境非常敏感，易受外界因素影响，特别是温度、光照等因素，制品在较长时间、较高温度及暴露于强光下，易产生聚合体及电荷异构体，为保证最终产品的质量，在设计稳定性试验时重点关注相关条件下产品的稳定性，包括中间产品稳定性、原液及成品的稳定性、容器相容性及对产品稳定性的影响等内容。
通过稳定性研究，明确产品的敏感条件及储存要求，具体可参照《中国药典》2020版9402 生物制品稳定性试验指导原则，重点关注以下内容：稳定性样品应能代表商业化规模下产品的质量，用于稳定性研究的成品应来自不同批次的原液；原液及产品的包装容器及密封系统应尽量与实际保持一致；由于该类产品结果的复杂性，采用单一的检测方法不能完全反映该类产品稳定性的特征，应基于产品的实际情况，对不同阶段的产品（如中间产品、原液、成品）开展稳定性研究，以全面反映各个阶段产品的质量符合预期目的；稳定性考察过程中应重点关注在不同考察时间点、不同条件下游离PEG的含量及未修饰原型蛋白、过修饰蛋白的变化情况，对于研究过程中的偏离情况应及时进行调查，以便于发现产品质量的不符合性。
5、 讨 论
重组蛋白制品的长效化研究是未来发展的必然趋势，机遇与挑战并存。相比于原型重组蛋白存在的缺点，PEG化重组蛋白具有更好的临床应用上的便利性与成本效益，随之具有广阔的市场前景，近年来越来越多的PEG化重组蛋白药物已经进入临床审批阶段。但同时，PEG化重组蛋白药物也暴露出一些问题，如PEG对蛋白药物空间屏蔽的作用会减弱蛋白药物与受体的相互作用，降低蛋白药物的生物活性，且PEG分子质量越大活性降低越多；高分子质量PEG在体内不易被代谢，容易聚集在肝等部位而引起大分子综合征，长期使用可能会对肝造成损伤；偶联在蛋白药物上的PEG可能会诱导产生抗PEG抗体，降低药效和安全性等特点，该类产品在研发及上市后应更加关注工艺的一致性及产品的安全有效性。
考虑到该类产品的特殊性，在CDE 2015年发布的《生物类似药研发与评价技术指导原则（试行）》中提到对PEG化等修饰的产品，在按照生物类似药研发时应慎重考虑。基于质量源于设计的理念，PEG化重组蛋白在前期的研发中设计符合要求的分子结构，生产过程中做好工艺控制与质量控制，稳定性研究中设计合理及时发现不良趋势，确保产品持续符合质量标准的要求最大限度的为患者提供质量可靠的长效治疗性药物。
