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什么是UPLC?和UHPLC、HPLC有什么区别?

嘉峪检测网        2023-11-27 08:35

HPLC
 
HPLC(High Performance Liquid Chromatography): 
 
又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”等,液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
 
UPLC
 
UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography):
 
色谱理论认为提高色谱柱的效能(efficiency)就能增加仪器的解析度(resolution),而运用粒径低于2μm的小颗粒无疑是增加效能的好方法。但减小固定相的粒度以增加色谱柱效能一直的色谱仪器科学的瓶颈,因为小颗粒不仅要求系统能承受高于目前极限压力(比如9000psi),需要更小的系统体积(死体积),并且需要能适应可能只有几秒峰宽的高速检测器。UPLC具有超低扩散体积(小于15μL)可尽可能发挥亚2μm色谱柱性能。色谱工作者使用UPLC结合小颗粒色谱柱可以获得更好的分离度,灵敏度,更快的分析速度。
 
UHPLC
 
UHPLC(Ultra-High Performance Liquid Chromatography):
 
UHPLC的诞生是UPLC 对色谱分离技术带来的一系列变化之一。UHPLC在制造技术,扩散体积和耐受压力方面进行了优化,使之能够匹配2.5~3.5μm颗粒度的柱子,大限度发挥色谱性能。采用颗粒更小的固相不仅可以实现更高的分辨率,同时还能缩短整体分析时间。
 
那么区分HPLC、UHPLC、UPLC的关键点就是分离性能。
 
HPLC vs UPLC
 
1、技术原理不同 
 
(1)UPLC的原理:借助于HPLC(高效液相色谱)的理论及原理,涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
 
(2)HPLC的原理:以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。
 
2、特点不同
 
(1)与传统的HPLC相比,UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍,它缩短了分析时间,同时减少了溶剂用量降低了分析成本。不过由于实验过程中仪器内部压力过大,也会产生相对应的问题。例如泵的使用寿命会相对降低,仪器的连接部位老化速度加快,包括单向阀等部位零件容易出现问题等。
(2)而HPLC,流动相为液体,流经色谱柱时,受到的阻力较大,为了能迅速通过色谱柱,必须对载液加高压;分析速度快、载液流速快,较经典液体色谱法速度快得多,通常分析一个样品在15~30分钟,有些样品甚至在5分钟内即可完成,一般小于1小时;分离效能高,可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果,比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍;灵敏度高,紫外检测器可达0.01ng,进样量在μL数量级;应用范围广,百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析,特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析,显示出优势。
 
HPLC vs UHPLC
 
最主要的部分是色谱柱的粒径。
 
HPLC如最常见的C18柱(5um,4.6mm * 250mm), 超高效液相色谱柱相对更小,如3.5um 3.0um,甚至更小,2.0um。由于粒径小,固定相的表面积变大。例如,一个5um的支柱就像一条充满石头的河流,一条2.0um的支柱是一条充满细沙的河流。通过这种方式,样品分离得更快,节省了大量的流动相和时间。但仪器上的压力会更高。
因此,超高效液相色谱(UHPC)的主要改进是提高其泵效率和组件耐压性。如果将小柱置于正常液相中,则确定柱压力将超过压力上限并且界面将泄漏。如果高效液相色谱(HPLC)充分利用这种小粒径色谱柱,则可以节省成本并获得更好的结果。
 
三者的区别
 
用文字总结为三大标准:
 
HPLC高效液相色谱:扩散体积>30μL,最高耐压<6,000 PSI的液相色谱系统,最适宜色谱柱粒径是5µm;
 
UHPLC超高效液相色谱:扩散体积15-30 µL,最高耐压≥9,000 PSI的液相色谱系统,最适宜色谱柱是粒径粒2-3.5μm的实心核颗粒色谱柱;
 
UPLC:扩散体积<15 µL,最高耐压≥15,000 PSI的液相色谱系统,最适宜色谱柱粒径是 <2µm。
 
至于上述各种类型色谱给用户带来的不同感受,大家可回顾和参考超高效液相色谱的好处:更高分离度、更高效率、更快速度、更省溶剂、更环保、更适合连接质谱等等。
 
小tips:学会正确维护UPLC
 
1、溶液的制备很关键
 
在色谱系统中,溶液是一个更重要的部分,那么UPLC中溶液的制备应该是怎样的呢?
 
样品溶液的制备
 
样品的制备同样是过滤和离心两种方法。
 
过滤:根据样品溶液的极性,选择不同材质的0.22um滤膜过滤。
 
滤膜的选择,要进行分析方法确证,滤膜的相容性实验。
 
*此处强调一下,必须是0.22um,千万不要用错。
 
离心:采用高速离心的方式(大于10000转/分钟)。
 
离心的方法一般适用于过滤较困难的溶液,为了保护UPLC的系统,离心完毕后建议再次进行过滤。
 
流动相的制备
 
所用有机相应是进口的色谱级别。使用的水应为超纯水,MILLI-Q纯水机生产的即可。
 
配制缓冲盐溶液应该有效期的规定,根据各实验室SOP规定。
 
所有的流动相用前必须使用0.22um的微孔滤膜过滤。
 
有很多同仁在平衡色谱柱时,因为使用的是甲醇/水或是乙腈/水系统,因为不涉及到缓冲盐溶液,经常把过滤这一步省略,再次提醒大家:
 
UPLC系统使用的所有流动相均必须经过0.22um的微孔滤膜过滤。
 
2、色谱柱的使用
 
若柱效不佳,将会浪费样品分析时间,问题排查时间,更是浪费宝贵样品。所以色谱柱的使用操作的规范性,直接决定UPLC的分析效率与数据可靠性。
 
首先,应与色谱柱的供应商沟通,充分了解色谱柱的性能,如反相柱、正相柱、氰基柱、亲水柱、离子交换柱等。
 
再次,建立色谱柱的管理SOP,在SOP中规定色谱柱的登记、启用、使用及报废记录,便于色谱柱整个生命周期的管理。
 
色谱柱的启用
 
色谱柱包装开启后一定要阅读说明书,关注说明书中的注意事项,如pH的适用范围、流动相中能否采用水、平衡时的流速,保留溶剂等。
 
对于正相色谱柱来说,最重点的时注意初始流速一定要小,一般0.2ml/min。
 
反相柱就比较麻烦一点了,先用小流速0.2ml/min的甲醇冲洗2小时,再用10%甲醇冲洗2小时,最后过渡到检品的流动相,流速由低逐步增加到目标流速。
 
柱子开始使用前,必须确认系统适用性测试是否满足要求,主要关注理论板数、分离度、拖尾因子等关键分离参数,验收合格后才能使用。
 
色谱柱的清洗和保存
 
正相色谱柱进样后一般无需刻意清洗,但是需要保存时,必须按照说明书要求选择溶剂,以免长时间引起固定相干涸。反相色谱柱清洗过程:高水相等度洗脱保证缓冲盐冲洗干净后,梯度洗脱的方式过渡到纯有机相,等度洗脱10~30柱体积,柱温可适当提高2~5度,方法运行完及时关闭柱温。
 
对于亲水作用色谱柱:最后保存尽量避免使用纯有机相,应包含少量的水,比如95%的乙腈。       
 
色谱柱的使用
 
使用色谱柱,应轻拿轻放,安装零死体积。
 
切忌由大流速变化引起的压力变化对色谱柱造成机械损伤,应使用逐渐提高流速的方法达到目标流速。
 
建立色谱柱的使用记录,记录中体现出理论板数、分离度拖尾因子、柱压、保留时间、流动相体系、保存溶剂等信息,一旦发现参数异常,以便展开调查,避免偏差发生。
 
色谱柱使用过程中,应关注其柱压、柱效,使用完毕后填写“色谱使用记录”。
 
色谱柱最好是专用,带保护柱。并且使用过缓冲盐的色谱柱最好不要用于新项目的方法开发。
 
低紫外区的检测,为了避免“鬼峰”的出现,可以使用捕集柱,色谱柱使用完毕后一定要按SOP及时清洗。
 
对于鬼峰捕集柱的使用,很多科研单位觉得不可行,不知道如何在标准中进行表达。其实在方法建立过程中,如果鬼峰无法避免,可以在“发展报告”中说明使用鬼峰捕集柱的理由,并在标准中如实描述,以便与厂家或是QC进行方法转移。
 
有关亲水性色谱柱,小编也有些提议:
 
以HILIK色谱柱为例,使用更少或是较弱的极性溶剂可以增加极性化合物的保留。
 
样品溶解的溶液尽可能接近流动相条件的初始条件,然而,极性大的分析物经常在有机溶液中存在溶解度较低的现象,可以先用水溶解样品,再用乙腈/水溶液进行稀释,需要平衡溶解度和峰形之间的关系,根据化合物性质,具体情况具体分析。
 
色谱柱的报废要素
 
1.色谱柱堵塞,压力升高1000psi。
 
2.色谱柱污染出现鬼峰、噪音增加、检测限增大时。
 
3.填料塌陷或污染引起色谱图前沿、拖尾、分叉时。
 
4.理论板数、分离度、拖尾因子按各检品质量标准规定执行,未规定的按各国药典通则规定执行,不符合上述规定时。
 
 
 
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