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液相色谱各种压力和基线问题全面大解析

嘉峪检测网        2022-01-08 23:21

液相色谱压力异常

 

液相系统压力产生的原因在于流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压或系统压力。漏液会引起系统压力的降低,而堵塞会引起系统压力的飙升。

系统压力的单位有:巴(Bar)、兆帕(Mpa)和磅/平方英吋(psi),它们之间的换算关系为1Bar=0.1Mpa=14.5psi。

 

1、影响因素

 

影响系统压力的因素主要有流动相的溶剂组成、温度及流速这三方面:

1)流动相的粘度是产生反压的主要原因,下图为有机溶剂-水的粘度随组成与压力的关系图:

 

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由上图可以看到,乙腈-水比例为(20:80)、甲醇-水比例为(40:60至50:50)时,系统的压力最大。因此,在做实验时应尽量避开这个比例范围。另外,异丙醇粘度大,一般不作流动相使用。

2)流速对反压的影响是线性关系,流速增加,反压亦增大。

3)温度对反压的影响是反比关系,温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些。

4)液相色谱仪各模块之间的连接管路也会产生压力,系统压力与管路的长度成正比,与管路直径的四次方成反比(1/4D)。上述考虑的是柱外因素对系统压力的影响,色谱柱对系统压力的影响也很大,反压与色谱柱长度成正比,与填料颗粒度的平方成反比(2.5μm填料比3.5μm填料反压高)。

 

2、压力原因

 

具体到压力问题的表现形式上,主要有压力高、压力低或没有压力以及压力不稳:

①造成压力高问题的主要原因有:

1)温度太低;

2)流速太高;

3)流动相粘度大;

4)管路堵塞;

5)仪器或色谱柱堵塞;

6)压力传感器问题。

系统压力高的故障排除流程图如下:

 

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②产生压力低情况的可能原因:

1)系统内有渗漏处;

2)单向阀堵塞;

3)入口管路有气泡;

4)溶剂滤头堵塞;

5)所用溶剂不正确,储液瓶中无溶剂;

6)温度太高,流速太低;

7)泵未输送流动相;

8)泵关闭或保险丝断了。

 

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以上为仪器单向阀的结构示意图,如果某些原因造成宝石球与球基座发生黏结,造成液体不能进入到泵中,从而造成泵的压力偏低。

 

3、造成压力波动可能的原因有:

1)脱气机排气不充分;

2)流动相未正确脱气;

3)所用溶剂不混溶或易挥发;

4)压力传感器及泵问题。

其中,大多数的压力波动都是由于气泡引起的(如下图):

 

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基线噪音问题

 

1、基线噪音大

 

1)流动相中有气体–溶剂脱气;

2)流动池中有气泡–在出口处使用0.009”的管路;

3)色谱柱上的污染物被洗脱–平衡系统,直至基线稳定;如样品中有保留非常强的组分,可设置强洗脱程序;

4)渗漏–此时应修复渗漏,重新连接或更换接头;

5)检测器灯能量低–更换灯;

6)灵敏度太高–使用合适的采样频率,调节增益(如ELSD检测器);

7)检测器流动池脏–清洁流动池;

8)电噪音–除去电噪音的来源:屏蔽电缆,清洁触点;

9)采样频率设置过大–一味追求高采样频率,可能对灵敏度没有任何帮助,同时也会产生比较大的噪音:UV检测器推荐降低采样频率,HPLC推荐1-5Hz,UPLC推荐20Hz。

 

2、同步的基线噪音

 

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1)大多数情况下都是泵引起的,泵头中存在空气–将溶剂脱气,并重新灌注泵;

2)单向阀问题–超声清洗单向阀或更换;

3)柱塞杆断裂–更换;

4)混合问题–更换一个体积更大的Mixer,以增加系统体积;

5)电噪音–改变电路,除去来源。

 

3、不同步的基线噪音

 

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1)气泡—流动相要脱气;

2)检测器中有气泡/空气—流动相脱气,或在检测器的后面加反压(不适用于RI检测器);

3)渗漏—特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏,会造成流速的变化和混合比例的变化,从而导致基线噪音,此时应修复渗漏,重新连接或更换接头;

4)管路堵塞—除去堵塞,冲洗系统;

5)电噪音—除去来源,改变电路。

 

4、基线漂移:上漂或者下漂

 

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1)梯度变化引起,如溶剂B的吸收值高于溶剂A–使用基线差减,或尝试新的流动相;

2)化合物从色谱柱上洗脱–平衡系统,直至基线稳定;如样品中有保留非常强的组分,可设置强洗脱程序;

3)溶剂改变(气体吸附,蒸发)–氦气脱气,隔离溶剂;

4)溶剂渗漏–拧紧或者更换接头;

5)检测器温度影响(尤其是示差,电化学以及电导检测器)–流动池温度调节;

6)柱温波动–等待柱温平稳,使用柱预加热器;

7)压力变化–过滤溶剂以及样品,或样品太粘稠;

8)混合问题–更换一个体积更大的Mixer,以增加系统体积。

 

5、Cyclic基线

 

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1)温度影响–隔离热源,或搬离临近的通风口,或增加流动池温度;

2)混合问题–更换一个体积更大的Mixer,以增加系统体积;

3)流动相中的气体–溶剂脱气;

4)泵不稳定–检查维修泵;

5)管路堵塞–冲洗系统,排除并除去堵塞源头;

6)电问题–改变电路,或除去根源。

 

6、基线上的毛刺

 

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1)气泡–溶剂脱气,并重新灌注泵,流动相脱气越好,基线就会越好;

2)信号连接不好,连线变松–清洁并拧紧检测器上的导线,或检查连线是否有损坏,或更换铲形接线片;

3)灯继电器试图点燃熄灭的灯–更换灯;

4)电噪音–更换电路,或除去根源。

 

7、小结

 

1)确保无电源及电噪音干扰;

2)为避免基线噪音,确保仪器系统内无气泡或空气,流动相首选过滤脱气;排尽管路、进样器、检测池中的气泡;选择合适的接头和管路,防止渗漏;

3)在编辑方法时,针对HPLC和UPLC仪器UV检测器设置合适的采样频率,HPLC推荐1-5Hz,UPLC推荐20Hz;

4)保持良好的操作习惯,如UPLC仪器水相流动相每天更换,添加了缓冲盐的流动相过0.2μm溶剂过滤膜等,都会减小基线噪音的产生。

 
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