药物中硝基类基因毒杂质的来源与控制方法_检测资讯

药物中硝基类基因毒杂质的来源与控制方法

嘉峪检测网 2021-04-27 14:10

概述:

最常见的硝基类化合物，主要有硝基咪唑类和硝基苯类等。硝基咪唑类药物及其代谢物对哺乳动物具有致突变性、致癌性和遗传毒性，被许多国家列为违禁药物。中国、欧盟和美国等已相继禁止将洛硝哒唑（RNZ）、地美硝唑（DMZ）和甲硝唑（MNZ）等药物用作饲料添加剂。《化妆品卫生规范》2015版中明确规定禁用了15种硝基咪唑类药物。2017年10月，世界卫生组织国际癌症研究机构将甲硝唑列为2B类致癌物。硝基苯类化合物是染料合成、油漆涂料、塑料、医药及农药制造等的中间体，属高毒污染物。托拉塞米合成过程中必须使用的间甲苯胺，可能引入杂质邻硝基甲苯，该杂质具有遗传致癌性杂质的警示结构；尼美舒利合成工艺可能引入杂质邻硝基二苯醚；阿哌沙班合成过程中，起始物料和中间体均存在硝基苯类化合物。因此需要建立一种专属性强、灵敏度高的方法对该类杂质进行控制。

药物中硝基类基因毒杂质的来源与控制方法

图1. 硝基咪唑类化合物结构图

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图2. 硝基苯类化合物结构图

参考各国药典及文献，总结了部分硝基类基因毒杂质药物的种类，详见表1。

表1. 含有硝基类基因毒杂质药物列表

基因毒杂质名称	药物名称
5-硝基二氢咪唑并噁唑类	德拉马尼（Delamanid）
5-硝基咪唑	甲硝唑（MNZ）
硝基咪唑	替硝唑
5-硝基咪唑	地美硝唑（DMZ）
5-硝基咪唑	洛硝唑（RNZ）
2-甲基-5-硝基咪唑	甲硝唑葡萄糖注射液
4-硝基-2苯氧基苯胺、邻硝基二苯醚	尼美舒利
邻硝基甲苯	托拉塞米、替米沙坦
对氟硝基苯、硝基吡格	盐酸吡格列酮
3-硝基邻苯二甲酸	坎地沙坦酯
氟硝基苯	奥氮平
溴硝基苯乙烯	罗匹尼罗

常用的检测方法:

直接检测法：

硝基咪唑类药物的化学性质较不稳定，见光遇热易分解，检测其在药品食品中的残留量较为困难。目前已开发的多种测定该类杂质在药品食品中的方法主要有液相色谱法、气相色谱法以及液相-质谱法（LC-MS）等。由于液相色谱法无法进行硝基咪唑类药物的确证分析，且在实际检测中发现，该方法容易出现假阳性结果。而LC-MS及LC-MS/MS技术集高效分离和多组分定性定量于一体，对不挥发和热不稳定的硝基咪唑类药物的分析具有独特的优势。有文献报道利用Waters ZQ 四级杆质谱（APCI源）同时对甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑进行检测，检测灵敏度可达0. 5 - 1 ng / ml。

表2. LC-MS法选择离子检测监测的离子及条件

化合物	检测离子	m/z	锥孔电压/v
甲硝唑	[M+H]⁺	172	29
	[M+H-CO₂]⁺	128	37
地美硝唑	[M+H]⁺	142	34
	[M+H-C₂H₅O]⁺	96	45
洛硝哒唑	[M+H]⁺	201	18
	[M+H-NH₂CO₂]⁺	140	40

衍生化法：

硝基苯类化合物被广泛用作合成活性药物成分（API）的原料或中间体。制药工业中使用的许多硝基苯类化合物都是非挥发性，因此GC的应用受到了限制。若直接使用LC-MS方法，对于缺乏电离效率的中性硝基苯类化合物并不适用。因此，通过化学衍生反应将硝基苯类化合物还原为高度可电离的芳基胺，从而能够定量检测痕量硝基苯类杂质。

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图3. 硝基苯类化合物的还原反应

如2-（溴甲基）-6-硝基苯甲酸甲酯本身缺乏离子化功能，无法直接用LC-MS进行检测，但是在甲酸铵和锌粉作用下，室温20 min即可将硝基还原为胺基。由于还原后的芳基胺质谱相应较强，还原后可使衍生产物的检测灵敏度达到0.2 ng / ml，在0.5 -10 ng /ml的线性R²达到0.9968，符合检测要求。对于其它硝基苯类化合物该方法同样适用，通用性较好，为大量低限度、难分离的硝基苯类化合物的方法开发提供了思路。

表3. 硝基苯类化合物还原产物的线性结果

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案例:

利奈唑胺：

利奈唑胺（Linezolid，化合物1，图2）化学名为(S)-N-{[3-(3-氟-4-吗啉基苯基)-2-氧代-5-唑烷基]甲基}乙酰胺，是第一个用于临床治疗革兰阳性球菌感染的恶唑烷酮类新型抗菌药物，2000年获得美国FDA批准上市，并于2009年获准在中国上市。利奈唑胺合成以3,4-二氟硝基苯为原料，经亲核取代、催化氢化、氨基保护、环合反应、盐酸化脱Boc、乙酰化等6步反应合成了利奈唑胺。该合成过程中可能残留的硝基苯类杂质A（3，4-二氟硝基苯）与杂质B（4-（2-氟-4-硝基苯基吗啉）均具有警示结构，马利华等开发了GC-MS法和HPLC法分别测定残留杂质A和B的残留量，本案例主要介绍杂质B的检测方法。

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图4. 利奈唑胺合成工艺

以流动相为0.1%三氟乙酸水溶液－0. 1%三氟乙酸乙腈溶液（62:38）等梯度洗脱，根据ICH指南要求，对该方法进行了检测限（LOD）、定量限（LOQ）、线性、精密度、准确性等相关验证，杂质B在15 - 60 ng / ml的范围内均成良好的线性关系，相关系数R² = 0.9979，杂质B的LOD和LOQ 分别能达到7.6 ng / ml及15 ng / ml，低中高平均回收率分别为97.9% 、98.2% 、97.5%，该方法灵敏度高，无干扰且操作简单，适合在痕量水平下对利奈唑胺中基因毒杂质B进行检测控制。

总结:

药物中痕量水平的遗传毒性杂质（GTI）由于其潜在的致癌作用而引起了制药行业和监管机构的日益关注。以ppm水平测定这些杂质需要高度灵敏的分析方法，这对药物研发中的分析界提出了巨大挑战。根据GTI的性质，经常开发复杂的分析方法，如衍生化法和质谱检测等，特别是在药物开发的研发阶段。因此，合理的科学理解和风险控制策略对于确保痕量GTI分析的方法性能至关重要。

本文根据以下文章进行编辑整理，仅用于学习、交流：

1. Vijaya B. R. etc. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2013, 84, 84-89.

2. Wu, X. etc. Anal. Methods. 2014, 6, 7277–7284.

3. 马利华等. 中国药品标准，2018，19 (1).

4. 王海等. 中国兽药杂志, 2005, 39, 8-11.

来源：Internet

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