本方案依据《中华人民共和国药典》2025年版四部微生物相关通则制定，旨在通过标准化实验，确认所采用的微生物限度检查方法（包括细菌、霉菌及酵母菌计数，控制菌检查）适用于供试品，能有效排除供试品自身抑菌活性的干扰，确保检查结果的准确性、可靠性和重现性，符合药品全生命周期管理及基于风险的质量控制要求，同时兼顾与ICH国际标准的协调一致性。
一、实验目的
1. 确认供试品在选定的实验条件下，无明显抑菌活性或其抑菌活性可通过适宜方法消除，保证试验菌能够正常生长繁殖。
2. 验证所采用的微生物计数方法、控制菌检查方法，能准确检出供试品中可能存在的微生物，满足25版药典对微生物限度检查的精度要求。
3. 确立供试品微生物限度检查的最优实验条件（如供试液制备方法、稀释梯度、冲洗条件等），为日常检验工作提供标准化依据。
4. 符合25版药典对微生物检查方法适用性实验的强制性要求，确保检验流程合规、结果可追溯。
二、实验依据
1. 《中华人民共和国药典》2025年版四部 微生物限度检查法（通则0111）、控制菌检查法（通则0112）及相关指导原则。
2. 2025年版《中国药典》微生物标准相关规范，兼顾ICH国际通行标准的协调要求。
3. 供试品的质量标准、理化特性及生物学特性相关资料。
三、实验范围
本方案适用于各类非无菌药品（包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、栓剂、呼吸道吸入给药制剂、直肠给药制剂及其他局部给药制剂）、药用辅料、医疗器械（非无菌类）的微生物限度检查法适用性实验，涵盖细菌、霉菌及酵母菌计数方法的适用性验证，以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等常见控制菌检查方法的适用性验证。
四、实验原理
微生物限度检查法适用性实验的核心的是通过对比试验，评价供试品对试验菌生长的影响。选取25版药典规定的标准试验菌，分别设置供试品试验组（含供试品+试验菌）、菌液对照组（不含供试品，仅含试验菌）、供试品对照组（不含试验菌，仅含供试品），必要时设置稀释剂对照组，通过测定试验菌的回收率（计数方法）或观察试验菌的检出情况（控制菌检查），判断供试品是否存在抑菌作用，若供试品存在抑菌活性，需通过稀释、中和、过滤等方法消除，确保检查方法能准确反映供试品的实际微生物污染情况，同时符合药典对菌种抗性、培养基适用性的相关要求。
五、实验材料与试剂
（一）实验仪器
1. 生物安全柜（二级，符合无菌操作要求）；2. 恒温培养箱（可调节温度30~35℃、23~28℃，精度±1℃）；3. 高压蒸汽灭菌器（可达到121℃、103.4kPa灭菌条件）；4. 无菌天平（精度0.1mg）；5. 无菌离心管（10mL、50mL）；6. 无菌移液管（1mL、10mL，精度±0.01mL）；7. 无菌培养皿（直径90mm）；8. 薄膜过滤器（滤膜孔径0.22μm、直径50mm）；9. 涡旋振荡器；10. 冰箱（2~8℃，用于菌种、培养基储存）；11. 菌落计数器（或菌落成像系统）；12. 干燥箱（用于实验用具烘干）。
（二）培养基
选用符合25版药典要求的脱水培养基，配制后经无菌检查合格方可使用，具体包括：营养琼脂培养基（用于细菌计数及培养）、玫瑰红钠琼脂培养基（用于霉菌及酵母菌计数）、改良马丁琼脂培养基（用于白色念珠菌、黑曲霉培养）、营养肉汤培养基（用于细菌增菌）、胆盐乳糖培养基（BL，用于大肠埃希菌增菌）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG，用于大肠埃希菌检测）、硫乙醇酸盐流体培养基（用于生孢梭菌培养），所有培养基需按规定条件储存，有效期内使用，同时严格遵循25版药典对培养基质控的调整要求。
（三）标准试验菌
选用25版药典规定的标准菌株，经复苏、传代后使用，确保菌株活性符合要求，具体包括：大肠埃希菌（CMCC 44102）、金黄色葡萄球菌（CMCC 26003）、枯草芽孢杆菌（CMCC 63501）、白色念珠菌（CMCC 98001）、黑曲霉（CMCC 98003）、铜绿假单胞菌（CMCC 10104）、乙型副伤寒沙门菌（CMCC 50094）、生孢梭菌（CMCC 64941），菌株储存、复苏、传代需符合菌种管理规范，避免污染及菌株退化。
（四）稀释液与冲洗液
1. pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（用于供试液稀释、菌液稀释，中和部分弱抑菌成分）；2. 0.9%无菌氯化钠溶液（用于菌液稀释、孢子洗脱）；3. 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液（用于黑曲霉孢子洗脱及油类供试品稀释）；4. 无菌生理盐水（用于常规稀释），所有稀释液、冲洗液均需经121℃、15min高压蒸汽灭菌，冷却后无菌保存，3周内使用。
（五）供试品
选取3个不同批号的供试品，批号需明确，储存条件符合供试品质量标准要求，供试品需在有效期内，取样过程需无菌操作，避免取样污染，取样量需满足实验需求（一般不少于10g或10ml）。
（六）其他试剂
无菌水、中和剂（如必要，用于消除供试品的强抑菌活性，如青霉素酶用于β-内酰胺类药物）、染色剂（如革兰染色液，用于控制菌鉴定）等，所有试剂均为分析纯或药用级，符合实验要求。
六、实验准备
（一）实验环境准备
实验需在洁净度不低于10000级、局部洁净度100级的无菌实验室（或生物安全柜）内进行，实验前需对实验室、生物安全柜、实验台面进行消毒（用75%医用乙醇擦拭消毒），消毒后静置30min，确保无菌环境；实验过程中需控制环境温湿度，避免影响试验菌生长及供试品稳定性。
（二）实验用具灭菌
将实验所需的培养皿、移液管、离心管、过滤器、烧杯、玻璃棒等用具，用牛皮纸包扎紧密，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃、15min高压蒸汽灭菌，灭菌后取出，置于干燥箱中烘干（或自然冷却至室温），放入无菌储物柜中保存，3天内使用；滤膜需经121℃、15min灭菌，冷却后备用，油类供试品所用滤膜及过滤器需提前充分干燥。
（三）培养基制备与灭菌
按培养基说明书要求，用纯化水溶解脱水培养基，搅拌均匀，必要时调节pH值至符合规定，分装至无菌容器中，2小时内放入高压蒸汽灭菌器中，121℃、15min灭菌（营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基等），改良马丁琼脂培养基可采用115℃、30min灭菌，灭菌后冷却至45~50℃，备用（避免温度过高影响培养基营养成分）；所有培养基灭菌后需进行无菌检查，取少量培养基接种至无菌培养皿中，分别在30~35℃、23~28℃培养48~72h，无微生物生长即为合格。
（四）标准试验菌复苏与菌液制备
1. 细菌、霉菌及酵母菌计数用菌液制备：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物少许，接种至10ml营养肉汤中，30~35℃培养18~24h；取白色念珠菌新鲜斜面培养物少许，接种至10ml改良马丁培养基中，23~28℃培养24~48h；取黑曲霉新鲜斜面培养物，加入3~5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子，制成孢子悬液。
2. 菌液稀释：将上述细菌、白色念珠菌菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液梯度稀释，制成每1ml含菌50~100cfu的试验菌液；黑曲霉孢子悬液用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成每1ml含菌50~100cfu的试验孢子液。
3. 控制菌检查用菌液制备：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌新鲜斜面培养物少许，接种至10ml营养肉汤中，30~35℃培养18~24h；取生孢梭菌新鲜斜面培养物少许，接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35℃培养18~24h，然后用0.9%无菌氯化钠溶液梯度稀释，制成每1ml含菌10~100cfu的试验菌液。
4. 菌液验证：菌液制备完成后，立即取1ml菌液注入无菌培养皿中，倾注相应培养基，平行制备2个平皿，细菌在30~35℃培养48h，霉菌及酵母菌在23~28℃培养72h，计数菌液浓度，确保符合50~100cfu/ml（计数用）或10~100cfu/ml（控制菌用）的要求。
（五）供试液制备
根据供试品的理化特性（水溶性、脂溶性、混悬性等），采用适宜的方法制备供试液，确保供试品均匀分散，同时尽可能消除其抑菌活性，具体方法如下：
1. 水溶性供试品：取供试品10g（或10ml），置于无菌烧杯中，加入适量pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，搅拌溶解（必要时可在45℃以下水浴加热助溶，时间不超过30min），转移至100ml无菌容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，制成1:10的供试液，必要时进一步梯度稀释（如1:100、1:1000）。
2. 脂溶性供试品（如软膏、乳膏、油剂）：取供试品10g，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的无菌混合物，用无菌玻璃棒搅拌成团，缓慢加入45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，充分乳化，制成1:10的供试液。
3. 混悬性供试品（如颗粒剂、散剂）：取供试品10g，加入适量pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，充分研磨、摇匀，制成混悬液，转移至100ml无菌容量瓶中，定容至刻度，摇匀，制成1:10的供试液，必要时加入助悬剂。
4. 含抑菌成分的供试品：若供试品具有明显抑菌活性（如含抗生素、防腐剂的供试品），可采用以下方法消除抑菌作用：① 梯度稀释法：将供试液进一步稀释（如1:100、1:1000），降低抑菌成分浓度；② 中和法：加入适宜的中和剂（如青霉素酶中和青霉素类药物，硫代硫酸钠中和含氯消毒剂）；③ 薄膜过滤法：取供试液适量，通过无菌滤膜过滤，用冲洗液（如pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）冲洗滤膜3~5次，每次冲洗量100ml，总冲洗量不超过1000ml，消除滤膜上残留的抑菌成分。
5. 供试液验证：供试液制备完成后，需进行无菌检查（供试品对照组），确认供试液本身无微生物污染，避免干扰实验结果。
七、实验步骤
（一）细菌、霉菌及酵母菌计数方法适用性实验
本实验采用平皿法或薄膜过滤法，根据供试品特性选择，实验分为4组，每组均平行制备2个平皿，3个不同批号供试品分别进行实验，具体如下：
1. 试验组：取制备好的供试液1ml（或适宜稀释度的供试液1ml），加入无菌培养皿中，再加入1ml试验菌液（每1ml含菌50~100cfu），轻轻摇匀，立即倾注45~50℃的相应培养基（细菌用营养琼脂培养基，霉菌及酵母菌用玫瑰红钠琼脂培养基），待培养基凝固后，倒置培养；细菌在30~35℃培养48h，霉菌及酵母菌在23~28℃培养72h。
2. 菌液对照组：取1ml试验菌液（每1ml含菌50~100cfu），加入无菌培养皿中，加入1ml无菌稀释液（与供试液稀释液一致），轻轻摇匀，倾注相应培养基，凝固后倒置培养，培养条件与试验组一致。
3. 供试品对照组：取1ml供试液（或适宜稀释度的供试液1ml），加入无菌培养皿中，加入1ml无菌稀释液，轻轻摇匀，倾注相应培养基，凝固后倒置培养，培养条件与试验组一致，用于确认供试液本身无微生物污染。
4. 稀释剂对照组：若供试液制备过程中采用了分散、乳化、中和、离心等特殊处理，需增设稀释剂对照组，取1ml稀释剂（或中和剂），加入1ml试验菌液，其余操作与试验组一致，用于考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。
5. 薄膜过滤法操作（适用于抑菌活性较强或难溶性供试品）：取供试液10ml（或适宜稀释度的供试液10ml），加入100ml无菌稀释液中混匀，倒入薄膜过滤器中，开启真空泵过滤；水溶性供试液过滤前，先用少量冲洗液润湿滤膜；油类供试品过滤前，确保滤膜及过滤器充分干燥。过滤完成后，用适宜的冲洗液冲洗滤膜3~5次，每次冲洗量100ml，最后一次冲洗时，在冲洗液中加入1ml试验菌液，继续过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于相应培养基平板上，倒置培养，培养条件与试验组一致；菌液对照组、供试品对照组、稀释剂对照组按上述薄膜过滤法操作，仅调整加入的溶液（菌液对照组加1ml菌液+10ml稀释液，供试品对照组加10ml供试液+10ml稀释液，稀释剂对照组加10ml稀释剂+1ml菌液）。
（二）控制菌检查方法适用性实验
选取25版药典规定的供试品对应的控制菌（如口服制剂需检查大肠埃希菌，外用制剂需检查铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等），采用增菌培养+分离培养+鉴定的流程，实验分为3组，3个不同批号供试品分别进行实验，具体如下：
1. 试验组：取供试液10ml（或适宜稀释度的供试液10ml），加入100ml相应的增菌培养基中（大肠埃希菌用胆盐乳糖培养基，金黄色葡萄球菌用营养肉汤培养基，铜绿假单胞菌用营养肉汤培养基），再加入1ml控制菌试验菌液（每1ml含菌10~100cfu），摇匀，置于30~35℃培养18~24h；培养完成后，取增菌液1ml，接种至相应的分离培养基平板上（大肠埃希菌用麦康凯琼脂培养基，金黄色葡萄球菌用甘露醇氯化钠琼脂培养基，铜绿假单胞菌用十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基），涂布均匀，倒置培养，培养条件与增菌培养一致，培养24~48h后，观察菌落生长情况，并进行鉴定（如革兰染色、生化反应等）。
2. 菌液对照组：取1ml控制菌试验菌液（每1ml含菌10~100cfu），加入100ml相应的增菌培养基中，摇匀，培养条件与试验组一致；培养完成后，取增菌液1ml，接种至相应分离培养基平板上，其余操作与试验组一致，用于确认试验菌能够正常增菌、生长。
3. 供试品对照组：取10ml供试液（或适宜稀释度的供试液10ml），加入100ml相应的增菌培养基中，摇匀，培养条件与试验组一致；培养完成后，取增菌液1ml，接种至相应分离培养基平板上，其余操作与试验组一致，用于确认供试液本身无目标控制菌污染，避免干扰鉴定结果。
（三）阳性对照试验
根据25版药典要求，结合质量风险管理原则，综合评估确定阳性对照试验的频次及要求，实验过程中同步进行阳性对照，确保实验系统有效。阳性对照采用相应的标准试验菌，操作与菌液对照组一致，若阳性对照未出现预期菌落生长，说明实验系统存在异常（如培养基失效、菌液失活、无菌操作污染等），需排查原因，整改后重新进行实验。
八、结果观察与判定
（一）细菌、霉菌及酵母菌计数方法适用性判定
1. 供试品对照组：均应无菌生长（无菌落出现），若出现菌落，说明供试液本身存在污染，需重新制备供试液，排查污染原因后重新实验。
2. 菌液对照组：菌落计数应在50~100cfu范围内，且菌落形态正常，说明试验菌活性良好，培养基合格；若菌落计数超出范围或无菌落生长，需重新制备菌液或培养基，重新实验。
3. 稀释剂对照组：菌落回收率（稀释剂对照组菌落数/菌液对照组菌落数×100%）应不低于70%，说明供试液制备过程中，稀释剂、中和剂等未对试验菌生长造成明显影响；若回收率低于70%，需调整供试液制备方法。
4. 试验组：计算每株试验菌的回收率（试验组菌落数/菌液对照组菌落数×100%），3个不同批号供试品的回收率均应不低于70%，且同一批号供试品平行平皿的菌落数偏差不超过10%，判定该计数方法适用于供试品；若回收率低于70%，说明供试品存在抑菌活性，需调整供试液稀释梯度、中和剂用量或过滤条件，重新进行实验，直至回收率符合要求。
（二）控制菌检查方法适用性判定
1. 供试品对照组：分离培养基平板上应无目标控制菌菌落生长，若出现目标控制菌菌落，说明供试液本身含有该控制菌，需排查供试品污染原因，重新实验。
2. 菌液对照组：分离培养基平板上应出现典型的目标控制菌菌落，且菌落形态、生化反应与标准菌株一致，说明试验菌能够正常增菌、生长，实验系统有效；若未出现典型菌落，需重新制备菌液或培养基，排查实验条件，重新实验。
3. 试验组：分离培养基平板上应出现典型的目标控制菌菌落，且菌落形态、生化反应与标准菌株一致，能够准确检出目标控制菌，判定该控制菌检查方法适用于供试品；若未检出目标控制菌，说明供试品存在抑菌活性或实验方法不当，需调整供试液制备方法、增菌条件或分离培养基，重新进行实验。
（三）实验结论
综合上述实验结果，明确判定所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法，以及各类控制菌检查方法，是否适用于该供试品；若适用，明确最优实验条件（供试液稀释梯度、制备方法、培养条件等）；若不适用，说明原因，并提出改进方案（如调整中和剂、采用薄膜过滤法等），直至实验合格。
九、注意事项
1. 实验全过程需严格遵循无菌操作原则，实验用具、培养基、稀释液、供试液等均需无菌，避免环境、操作人员造成的污染，实验结束后，对实验废弃物进行灭菌处理（121℃、30min高压蒸汽灭菌），防止菌种扩散。
2. 标准试验菌的复苏、传代、储存需严格遵循菌种管理规范，传代次数不超过5代，避免菌株退化、污染，菌液制备完成后需立即使用，不得长时间存放（室温存放不超过2h，2~8℃存放不超过24h）。
3. 培养基的配制、灭菌需严格按照说明书要求操作，调节pH值至规定范围，灭菌时间、温度准确，避免培养基营养成分破坏；培养基灭菌后需及时冷却，避免凝固，备用培养基需在有效期内使用，出现浑浊、污染、变色等异常情况时，禁止使用。
4. 供试液制备过程中，加热温度不得超过45℃，时间不超过30min，避免高温破坏供试品中的抑菌成分或导致微生物死亡；含抑菌成分的供试品，需通过预实验确定最优的消除抑菌作用的方法，确保实验结果准确。
5. 实验过程中需及时、准确记录各项实验数据（供试品批号、菌液浓度、培养时间、菌落数、鉴定结果等），记录需清晰、可追溯，符合25版药典及实验室质量管理规范要求，不得涂改、伪造。
6. 若实验过程中出现异常情况（如菌落计数异常、未检出试验菌、供试品污染等），需及时排查原因（如菌液失活、培养基失效、无菌操作污染、供试液抑菌活性未消除等），整改后重新进行实验，并记录异常情况及处理措施。
7. 实验人员需经专业培训，熟练掌握25版药典微生物限度检查相关规范、实验操作技能及安全防护知识，持证上岗，实验过程中做好个人防护（穿戴无菌手套、口罩、防护服等），避免菌种感染。
8. 实验环境温湿度需严格控制，避免影响试验菌生长及供试品稳定性，实验结束后，对实验室进行全面消毒，保持环境洁净。
十、实验记录与归档
1. 实验记录需包含以下内容：实验名称、实验日期、供试品名称、批号、规格、生产厂家、取样量、实验依据、实验人员、复核人员；实验用具、培养基、标准试验菌、稀释液等的名称、批号、生产厂家、灭菌情况；供试液制备方法、稀释梯度；实验步骤、各组实验条件；菌落计数结果、回收率计算、控制菌检出情况；异常情况及处理措施；实验结论等。
2. 实验记录需及时、准确、完整，由实验人员签字确认，复核人员复核签字，确保记录可追溯，符合实验室质量管理规范及25版药典要求。
3. 实验完成后，将实验记录、实验报告、供试品质检报告等相关资料整理归档，归档期限不少于供试品有效期满后1年，便于后续查阅、追溯及监管检查。
十一、实验周期
本实验周期为5~7天，具体如下：实验准备1天（仪器消毒、培养基制备、菌液复苏）；供试液制备及实验接种1天；细菌培养48h、霉菌及酵母菌培养72h；结果观察、计数、鉴定1天；实验记录整理、报告撰写1天；若实验过程中出现异常情况，需延长实验周期，直至实验合格。
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