摘 要： 建立了高效液相色谱测定道地产区金银花药材指纹图谱及化学模式识别分析方法。采用Phenomenex Synergi Hydro-RP80 A 色谱柱（250 mm ×4.6 mm，4 μm），柱温为25°C，梯度洗脱以流量为1.0 mL/min的乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，检测波长为327nm，建立25批不同产地金银花药材的指纹图谱，并用聚类分析和主成分分析等统计学研究方法以及《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统》（2012年版）对25批金银花样品进行质量分析，标示了13个共有峰，指认了其中的6个共有峰，25批金银花样品中有88%的样品相似度大于0.91。对25批三大道地产区的金银花样品进行的聚类分析和主成分分析，结果显示A与B产区的金银花药材的成分均一性总体低于C产区的金银花药材，同时研究了金银花与山银花的混淆区分，为金银花的掺伪鉴别提供参考。该方法可对金银花药材内在质量做出评价，进一步加强了金银花药材的质量控制，为药材的鉴别、品质评价、市场规范、中药制剂安全性、行业标准化等方面提供重要的理论基础。

 

关键词： 金银花药材； 指纹图谱； 化学模式识别； 质量控制； 相似度评价

 

金银花始载于《神农本草经》，为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花[1]。作为国家管理的38种名贵中药材之一的金银花，其叶、茎、花均可入药，尤其以花药效最强[2]。金银花具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫、保肝、止血等功效[3‒11]，主产于山东、河南、河北[12]。金银花药材现标准收载于2020年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）一部[13]，仅以绿原酸一种成分做薄层色谱法定性鉴别，研究表明金银花中含有包括有机酸类、环烯醚萜苷类等多种化学成分[14‒17]，金银花药材的质量控制常用方法有高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、毛细管电泳及高相液相质谱联用法等[18‒19]，测定成分多集中于《中国药典》要求的两类化合物。我国中医药的发展尤其重视道地药材，目前的研究多存在样品产地单一不具代表性，不足以反映我国几大道地产区现状等问题[20]。同时由于山银花价格远低于金银花，市场上金银花与山银花等互混、互代的现象十分严重[21‒22]，这种现象不同程度地影响了中药制剂的疗效。笔者建立了一个更加科学稳定的金银花药材高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统》软件和SIMCA-P 14.1及SPSS软件分析，对我国三大道地产区的25批金银花药材进行进行质量评价，同时利用该指纹图谱与山银花做了混伪品区分，是能够全面地反映金银花整体质量的综合分析方法，为其质量标准提高研究提供科学依据。

 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent1260型，配有G1315C型二极管阵列检测器，安捷伦科技(中国)有限公司。

电子分析天平：AE240型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

电热鼓风干燥箱：GZX-9070MBE型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

高速粉碎机：800Y型，永康市铂欧五金制品有限公司。

超声波清洗器：KQ-100DE型，昆山市超声仪器有限公司。

绿原酸、木犀草苷对照品：质量分数分别为99.3%、94.9%，批号分别为110753-202119、11720-202111，中国食品药品检定研究院。

异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、新绿原酸对照品：质量分数均为98.0%，批号分别为J0202AS、D1018AS、D0507AS、N0805AS，大连美仑生物技术有限公司。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

磷酸：分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

实验用水为超纯水。

实验用25份金银花，均经沈阳药科大学中药学院路金才教授鉴定为忍冬科植物忍冬的干燥花，药材来源信息见表1。

表1   金银花样品来源

Tab. 1   Sources of honeysuckle samples

 

1.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP80A柱(250 mm × 4.6 mm，4 µm，美国飞诺美公司)；流动相：A相为乙腈，B相为0.1%磷酸溶液，流量为1.0 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：25°C；进样体积：10 µL；洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序见表2。

表2   梯度洗脱程序

Tab. 2   Gradient elution procedure

 

1.3 溶液配制

金银花样品溶液：按四分法取适量金银花的干燥花，用高速粉碎机粉碎成粗粉，混匀。称取过筛（孔径为0.25 mm）后的样品粉末约0.50 g于具塞锥形瓶中，用移液管加入70%甲醇溶液25.00 mL，用天平称重并记录，经超声波处理（功率为250 W，频率为35 kHz）40 min，冷却，再次于天平称重并记录。缓慢地用70%甲醇补充减少的质量，直至与上次质量相当，混匀后用0.22 μm的微孔滤膜过滤。精密量取续滤液3.00 mL，置10.00 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至标线，混匀。混合对照品溶液：分别精密称取适量的异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、新绿原酸、木犀草苷、绿原酸对照品于10.00 mL容量瓶中，加入甲醇定容至标线，混匀，得6种对照品质量浓度分别为0.66、0.085、0.148、0.164、0.243、2.89 mg/mL的混合溶液。空白溶剂：取水作为空白溶剂。

1.4 实验方法

取金银花样品溶液，按1.2色谱条件进样，记录色谱图。将25批样品的色谱图导入 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），进行相似度评价。采用SIMCA-P 14.1及SPSS软件对25批样品进行主成分分析及聚类分析。

 

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

《中国药典》（2020版）中指出金银花中绿原酸、木犀草苷最大检测波长分别为327、350 nm。金银花中含多种化学成分，需同时对多种成分进行分析，故利用二极管阵列检测器对6种对照品进行全波长扫描，全波长紫外吸收光谱如图1所示。

图1   6 种对照品的紫外线吸收光谱

Fig. 1   UV absorption spectrum of 6 controls

从图1可以看出，在327 nm波长附近，新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷6种成分均有明显吸收，且各目标成分的色谱峰分离度良好，因此最终选择327 nm作为检测波长。

2.1.2 流动相的选择

因金银花药材的多种功效成分大多具有较高的极性，同时参考《中国药典》2020版一部“金银花”项下的含量测定方法进行流动相的考察[13]。考察当有机相分别为乙腈、甲醇时，6种成分的色谱峰面积、分离度及峰形。结果表明，选取乙腈为有机相时，各成分的峰形和分离度更优，因此选用乙腈为有机相。考察水相分别为纯水、0.1%甲酸溶液、0.3%甲酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液时，6种成分的峰面积、分离度及峰形。结果表明，加入磷酸后，各成分经色谱柱分离后峰形更好，分离度更高，且0.2%磷酸溶液和0.1%磷酸溶液分离效果无明显差别，考虑到色谱柱的耐酸性有限，酸性过强会对色谱柱造成损害，所以最终选择水相为0.1%磷酸溶液。

2.1.3 色谱柱的选择

选用Agilent 1260和WATER 2489两套HPLC系统，分别用Phenomenex Synergi Hydro-RP80A柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）、InfinityLabPoroshell 120 EC-C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）、Accucore™ XL C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）3种均以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱进行考察。结果表明，不同色谱系统、不同色谱柱对金银花样品各成分保留时间和分离度影响较小。参考文献[23‒24]的研究成果，分别考察色谱柱填充粒径为4、5 µm的色谱柱时6种成分的峰面积、峰形以及分离度。结果表明，使用5 µm粒径的色谱柱时，绿原酸与木犀草苷等成分分离效果并不理想，使用粒径为4 µm的色谱柱分离效果更好，各成分色谱峰面积更大，且峰形更佳。综合考虑，色谱柱选择Phenomenex Synergi Hydro-RP80A柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）。

2.2 金银花药材指纹图谱

2.2.1 HPLC指纹图谱的建立及相似度评价

移取25批金银花样品粉末适量，按照1.3方法制备样品溶液，再按照1.2色谱条件进样，记录其HPLC指纹图谱，A、B、C 3个产区的金银花HPLC指纹图谱如图2所示。

图2   不同产区金银花HPLC指纹图谱

Fig. 2   HPLC fingerprint of Lonicera japonica Thunb from different habitats

将25批样品的HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），对25批金银花样品的特征指纹图谱进行相似度计算。首先以S24号金银花样品溶液的特征图谱作为参照图谱，以中位数法作为生成对照特征图谱的方法，设定时间窗宽度为0.1 min，生成对照特征图谱作为金银花的特征图谱。将参照谱图（S24号）的保留时间和峰面积记为1，计算不同产地金银花样品各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，利用“相关系数”法计算各金银花全图谱的相似度，参与共有模式建立的25个金银花样品的HPLC指纹图谱如图3所示。

图3   25个金银花样品的HPLC指纹图谱

Fig. 3   HPLC fingerprint of 25 honeysuckle samples

1~13—共有色谱峰

2.2.2 共有峰的指认及归属

根据图3相似度评价系统给出的共有峰是13个，将13个共有峰作为金银花指纹图谱的稳定特征峰，利用对照品进行特征峰的指认，将6种对照品的混合溶液按照1.2色谱条件进样分析，金银花中 6 种成分的保留时间见表3。由表3可知，通过比对色谱保留时间，确定3、4、9、10、11和13号峰分别为新绿原酸、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C。

表3   金银花中 6 种成分的保留时间

Tab. 3   Retention time of 6 components in honeysuckle

 

2.2.3 指纹图谱重复性试验

按1.3方法制备样品溶液，将同一金银花样品制备成6份样品溶液，按照1.2色谱条件进样，以共有峰11号（异绿原酸A）为参照峰，记录相对保留时间和相对峰面积，结果见表4。由表4可知，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差均小于1.0%，相对峰面积的相对标准偏差均小于2.0%，证明所建立的高效液相特征图谱具有良好的重复性。

表4   金银花药材指纹图谱方法学验证结果（n=6）

Tab. 4   Methodological validation results of fingerprinting of honeysuckle medicinal materials (n=6) ( % )

 

2.2.4 指纹图谱稳定性试验

按照1.2色谱条件，将同一样品溶液分别于制备后0、4、8、12、24、48 h内进样，以共有峰11号（异绿原酸A）为参照峰，记录各共有峰的保留时间和峰面积，结果见表4。由表4可知，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于2.0%，说明所建立的高效液相特征图谱在48 h内具有良好的稳定性。

2.2.5 指纹图谱相似度计算结果

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），以25批金银花药材样品的HPLC指纹图谱生成的对照指纹图谱为参照，进行整体相似度评价，分析结果见表5。对表5数据统计可知，88%的金银花样品与对照特征图谱的相似度大于0.91，表明相似的化学成分存在于这些不同批次的样本中。其中，S1、S15、S16样品的相似度低于其他批次样品，说明这几批样品质量可能存在问题。

表5   金银花相似性分析

Tab. 5   Analysis of honeysuckle similarity

 

2.3 化学模式识别分析

2.3.1 聚类分析

应用SPSS 21.0.0.0软件对25批金银花样品指纹图谱进行聚类分析，以色谱峰面积百分比（PPA）数据展开，采用平均联接（组间）法，以夹角余弦法为相似度测度进行聚类分析，金银花的聚类谱系图如图4所示。

图4   金银花的聚类谱系图

Fig. 4   Cluster pedigree of honeysuckle

通过聚类分析，25批金银花样品被分为两大类，分类结果见表6。

表6   聚类分析分类结果

Tab. 6   Result of classification by cluster analysis

 

2.3.2 主成分分析

利用SIMCA-P 14.1及SPSS软件分析对25批样品进行主成分分析，选择偏最小二乘辨别（PLS-DA）进行分析，主成分分析结果见表7。由表7可知，当选取3个主成分时，累积贡献率为84.1%，可体现变量中大部分信息，且R2Y为0.834，Q2为0.637，通常R2Y、Q2数值接近1，说明模型稳定，当两者高于0.5时，说明该模型预测能力好。

表7   主成分分析特征值

Tab. 7   Characteristic value of PCA

 

对PLS-DA的得分图进行分析，横坐标和纵坐标分别代表不同样品在主成分PC1和PC2上投影的得分值，25批样品PCA得分图如图5所示。从图5可以看出，S19样品已经不在95%的置信区间内，表明该模型对此样品无法进行较好分析。距离横坐标或者纵坐标的零点较近的样品对该主成分的贡献值较小，反之则较大。得分图将25份样品分成两组，红色方形的样品位置相对较近，被分成第一类样品；黑色方块的样品位置相对较远，被分为第二类。

图5   25批样品PCA得分图

Fig. 5   PCA score plot for 25 batches of samples

进一步对PLS-DA的载荷图进行分析，载荷图中每一个三角形代表一个共有峰，距离横轴与纵轴原点越远的点代表该成分权重值越大，在决定样品区分中的作用越大，25批样品PCA载荷图如图6所示。

图6   25批样品PCA载荷图

Fig. 6   PCA load plot of 25 batches of samples

从图6可以看出，峰8、峰11、峰13对不同批次样品起到更加重要的区分作用。进一步对模型的变量投影（VIP）进行分析，通常以VIP值大于1为筛选标准，说明该成分的贡献较大，PCA各共有峰的VIP图如图7所示。从图7可以看出，共得到贡献相对较大的6个变量色谱峰，依次为峰11、峰8、峰13、峰6、峰10、峰5。

图7   PCA各共有峰的VIP图

Fig. 7   VIP plot of each peak shared by PCA

2.4 混淆品区分

自1977年开始，到2000年版《中国药典》一直未将山银花与金银花作以区分，自2005版《中国药典》才开始区分两者。由于金银花产量低、临床药用功效大且需求量逐年升高，如今市场上山银花冒充金银花的现象屡见不鲜。为了能够准确、快速将两者区分，按1.3方法制备山银花样品溶液，在1.2色谱条件下测定。在327 nm的检测波长下，绿原酸和异绿原酸峰面积过大、含量较高，导致其他成分间的差异表现不明显，不能较好区分金银花和山银花；将检测波长改为240 nm，得到的金银花色谱图和山银花色谱图差异明显，二者可在240 nm波长下得到较好区分。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对金银花和山银花样品在240 nm波长下得到的HPLC特征图谱进行相似度计算，用“相关系数”法计算金银花和山银花全图谱的相似度为0.77，金银花和山银花得到较好地区分。金银花和山银花相似度谱图如图8所示。

图8   金银花和山银花相似度谱图

Fig. 8   Similarity chromatogram of honeysuckle and honeysuckle

S1—山银花； S2—金银花

t/min

 

3 结论

建立了测定金银花药材的高效液相色谱指纹图谱法，得到能够标示其化学特征的色谱图，采用该方法测定了25批不同产地金银花药材的指纹图谱，对色谱条件和提取条件进行了优化，方法准确、可靠、重现性好；建立了金银花指纹图谱的共有模式，标示了13个共有峰，指认了其中的6个共有峰，并对指纹图谱特征及其相关性进行深入分析，25批金银花样品中有88%的样品相似度大于0.91，3批相似度低于0.91的样品均产自A产区。对25批三大道地产区的金银花样品进行的聚类分析和主成分分析，结果显示A与B产区的金银花药材的成分均一性总体低于C产区的金银花药材，建立的金银花药材的高效液相色谱指纹图谱法能够有效评估其功效成分的一致性及稳定性，为其制剂的质量控制提供依据。探讨了金银花与山银花的混淆区分问题，为金银花的掺伪鉴别提供参考，进一步加强了金银花药材的质量控制，为药材的鉴别、品质评价、市场规范、中药制剂安全性、行业标准化等方面提供重要的理论基础。

在金银花药材的指纹图谱研究需结合多维度分析手段进一步深入与细化研究，未来可通过扩大样本范围进一步考察不同采收期，不同种植条件，不同加工方式，不同贮存条件对金银花药材功效成分的影响，深入剖析金银花药材质量差异的本质原因，为未来金银花药材的高效种植提供理论支持和实践指导。

 

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